Soi optimal

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 9483 (2022) Citer cet article

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Les nanoparticules lipidiques (LNP) pour la délivrance d'ARN et d'ADN ont attiré une attention considérable pour leur capacité à traiter un large éventail de maladies et à vectoriser l'ARNm pour les vaccins COVID. Les LNP sont produits en mélangeant des biomolécules et des lipides, qui s'auto-assemblent pour former la structure souhaitée. Dans ce domaine, la microfluidique présente des avantages évidents : qualité de mélange élevée, conditions de faible contrainte et préparation rapide. Des études de PNL produits dans des micromélangeurs ont révélé, dans certaines gammes de débits, une dégradation des performances en termes de taille, de monodispersité et d'efficacité d'encapsulation. Dans cette étude, nous nous concentrons sur le micromélangeur annulaire, qui est bien adapté aux hauts débits. Nous révélons trois régimes, côte à côte, transitoires et hautement mixtes, qui contrôlent les performances de mixage de l'appareil. De plus, en utilisant la cryo-TEM et l'analyse biochimique, nous montrons que les performances de mélange sont fortement corrélées aux caractéristiques des PNL que nous produisons. Nous soulignons l'importance du rapport de débit et proposons un critère physique basé sur l'apparition d'instabilités temporelles pour produire des PNL avec des caractéristiques optimales en termes de géométrie, de monodispersité et de rendement d'encapsulation. Ces critères sont généralement applicables.

De nombreuses avancées ont été réalisées au cours de la dernière décennie. En effet, depuis l'apparition des premiers micromélangeurs au début du siècle, une centaine de dispositifs fonctionnels basés sur divers concepts ont été développés. Tous ont des avantages et des inconvénients, mais dans l'ensemble, les utilisateurs trouvent souvent des géométries correspondant à leur application d'intérêt dans le catalogue des mélangeurs microfluidiques1,2,3. Ces dernières années, l'idée d'utiliser ces dispositifs pour produire des LNP (nanoparticules lipidiques) a émergé4,5. Les LNP sont devenus l'étalon-or pour la délivrance d'acides nucléiques6. Ce sont des nanoparticules complexes, de 50 à 100 nm de diamètre, composées principalement de lipides ionisables cationiques qui peuvent se séparer des autres composants lipidiques lorsque leurs charges sont neutralisées, conduisant à la formation de gouttelettes d'huile amorphe au cœur des PNL, comme décrit dans un étude récente7,8. La molécule thérapeutique dans le LNP dépend de l'application. Il peut s'agir d'ADN, d'ARNm ou d'ARNsi. Les entités fonctionnelles piégées ou adsorbées à l'interface comprennent des fragments PEG (généralement liés à une chaîne lipidique), des lipides auxiliaires et du cholestérol. Les nanoparticules lipidiques offrent de nombreux avantages par rapport aux systèmes d'administration d'acides nucléiques à base de lipides précédents : efficacité élevée d'encapsulation des acides nucléiques, transfection plus puissante, pénétration tissulaire améliorée et faible cytotoxicité et immunogénicité. Ces caractéristiques font des nanoparticules lipidiques d'excellents candidats pour la délivrance d'acide nucléique, comme l'ont démontré les vaccins à base d'ARNm contre le COVID.

Les TNL sont formés par un processus d'auto-assemblage. Des simulations numériques suggèrent que le processus d'auto-assemblage comprend trois étapes : l'assemblage des particules en grappes discoïdes, l'agrégation des grappes en patchs membranaires plus grands et la formation de vésicules9. L'auto-assemblage par diffusion serait trop lent (cela prendrait des jours), donc un mélange hydrodynamique est nécessaire. L'utilisation de mélangeurs standards5 dans de grands conteneurs est une option. Cependant, ces mélangeurs génèrent une polydispersité de taille ainsi qu'une faible efficacité d'encapsulation. Par conséquent, des étapes de post-traitement telles que la filtration, l'extrusion et la centrifugation sont nécessaires pour améliorer la qualité des PNL produits de cette manière. Dans ce contexte, l'utilisation de mélangeurs microfluidiques est pertinente. Il a récemment été démontré que la microfluidique permet la production de TNL de qualité acceptable en termes de monodispersité et de rendement d'encapsulation en une seule étape avec des rendements élevés. Dans Fujishima et al.10 et Shepherd et al.11, un micromélangeur à chevrons décalé12 a été utilisé. Une limitation des micromélangeurs à chevrons est leur faible débit. Cette limitation peut être contournée en parallélisant le système11. Cependant, cette option génère de la complexité, augmente le coût et réduit la fiabilité. Les micromélangeurs inertiels qui fonctionnent à des débits nettement plus élevés et donc à des débits plus élevés offrent une solution, mais jusqu'à présent, bien que certaines indications puissent être trouvées dans la littérature, les conditions dans lesquelles ils doivent être utilisés pour obtenir des LNP fonctionnels n'ont pas encore été complètement élucidées.

Dans le présent article, nous nous concentrons sur un micromélangeur basé sur Dean13,14,15,16,17, un membre de la classe des micromélangeurs inertiels. Il est bien adapté aux cadences élevées et donc à la production de masse. Nous identifions, en bon accord avec les calculs numériques18, trois domaines de débits. L'un d'eux, appelé « régime de transition », jouera un rôle important dans l'identification des conditions d'écoulement optimales. Pour obtenir des PNL avec des caractéristiques optimales en termes d'efficacité d'encapsulation (EE), de taille, de charge et de monodispersité, nous montrons qu'il faut opérer à des débits supérieurs au régime de transition. Travailler en dessous ou dans le régime de transition, toujours en termes de débits, conduit à des performances dégradées. En accord avec la littérature, nous décrivons ainsi les conditions physiques dans lesquelles des PNL de qualité acceptable peuvent être obtenus en utilisant un critère physique qui n'a pas été proposé auparavant. Nous discutons également du rôle important du rapport de débit entre la phase aqueuse (contenant les acides nucléiques) et la phase organique (contenant les lipides).

Dans notre formulation LNP, le 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), le 1,2-dimyristoyl-rac-glycéro-3-méthoxypolyéthylène glycol-2000 (DMG-PEG2000) et le cholestérol (d'origine végétale) ont été acheté chez Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Dlin-MC3-DNA, désormais appelé MC3, a été obtenu auprès de SAI Life Science (Hyderabad, Inde). L'acide citrique et le citrate de sodium tribasique déshydraté ont été acquis auprès de Sigma – Aldrich (France). Une solution saline tamponnée au phosphate 10X (PBS, pH 7,4) a été obtenue auprès de Thermo Fisher Scientific (France). Le plasmide gWiz-GFP a été acheté chez Aldevron (Dakota du Nord, États-Unis).

Pour produire des LNP, les lipides ont été solubilisés dans de l'éthanol à des rapports molaires de 50:10:38,5:1,5 pour MC3, DOPC, cholestérol et PEG-lipide, respectivement. Le mélange lipidique a été mélangé avec du tampon citrate 50 mM à pH 4 contenant de l'ADNp en utilisant la cartouche microfluidique NxGen (de Precision NanoSystems, Vancouver). Le rapport azote sur phosphate (N/P) entre le lipide ionisable et l'ADNp a été maintenu à 6. Les effets du débit (FR ; allant de 0,4 à 20 mL/min), du rapport aqueux sur organique (FRR ; de 1:1 à 10:1) et les concentrations finales de lipides et d'ADNp (de 1,44 à 15 mg/mL et de 93 à 965 µg/mL, respectivement, pour les lipides et l'ADNp) ont été évaluées. Pour toutes les formulations, les volumes de déchets initial et final ont été fixés à 0,45 et 0,05 ml, respectivement. Une fois la formulation traitée dans le micromélangeur, l'éthanol a été éliminé du produit et le tampon citrate a été éliminé par PBS en utilisant des filtres Amicon Ultra Centrifugal (EMD Millipore, Billerica, MA). Les formulations ont finalement été passées à travers un filtre de 0,22 μm et stockées à 4 ° C jusqu'à leur utilisation.

La taille des particules, l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta ont été mesurés par diffusion dynamique de la lumière à l'aide d'un Malvern Zetasizer NanoZS (Worcestershire, Royaume-Uni). Les LNP ont été dilués 100 fois dans du PBS et ajoutés à une µ-cuvette. Les valeurs d'indice de réfraction (RI) et de viscosité du dispersant (PBS) étaient respectivement de 1335 et 1,02 cP, tandis que l'IR du matériau était de 1,45.

L'efficacité d'encapsulation de l'ADNp a été déterminée à l'aide du test d'ADN PicoGreen (Life Technologies, Burlington, ON). En bref, 100 µL du colorant fluorescent dilué ont été ajoutés à 100 µL de LNP dilués en présence ou en l'absence de 1 % (p/v) de Triton-X100 dans du tampon TE et incubés en l'absence de lumière pendant 5 min. Les acides nucléiques ont été quantifiés en mesurant la fluorescence (ex/em = 480 nm/520 nm) à l'aide d'un fluorimètre (lecteur Varioskan Lux Microplate, Thermo Fisher). Une courbe d'étalonnage linéaire jusqu'à 1000 ng/mL a été réalisée en utilisant l'échantillon d'ADN standard fourni dans le kit.

Le taux d'encapsulation a été calculé par la formule suivante :

La morphologie des LNP a été observée par cryo-microscopie électronique. Un total de 4,1 µL de PNL concentrés a été déposé sur des grilles de cuivre Quantifoil R2/2 300 mesh (Quantifoil Instruments GmbH, Allemagne) après 90 s de décharge luminescente sur un ioniseur ELMO (Cordouan, France). Les grilles ont été buvardées et congelées à l'aide d'un Vitrobot MARK IV (Thermo Fisher Scientific, USA) et transférées sur un TEM tecnai-G20 (ThermoFisher Scientific, USA) fonctionnant à 200 kV à l'aide d'un cryo-support 910 (Gatan, Inc., USA) pour observation. Les images ont été enregistrées à une défocalisation de 4 µm et en mode faible dose (doses d'électrons entre 10 et 15 e−/Å2) à l'aide d'un ssCCD Ultrascan 4000 (Gatan, Inc., USA). La taille des pixels des images enregistrées a été estimée à 0,221 nm après étalonnage TEM à l'aide d'une grille en croix (EMS, USA) avec un espacement de pas de 500 nm et 2000 lignes/mm.

Le dispositif microfluidique utilisé pour produire des LNP est illustré à la Fig. 1.

(A) Image du microdispositif rempli d'une solution de fluorescéine. (B) Croquis du microdispositif montrant Sect. 1, la région d'entrée, et Sect. 2, y compris les quatre anneaux et les jonctions entre eux. Dans les expériences de modèle de fluide, Q1 est de l'eau et Q2 est de l'éthanol avec 0,1 % w/w de fluorescéine. Dans les expériences LNP, Q1 représente la phase aqueuse contenant l'acide nucléique dilué dans un tampon acide, et Q2 représente la phase éthanol contenant les lipides. (C) Vue tridimensionnelle de l'appareil, montrant les cales associées à la technique de moulage de la microfabrication. Les dimensions des canaux ont été mesurées par profilométrie optique (voir Fig. 2).

Le système comprenait une série de quatre tores reliés par des canaux droits. Le dispositif a été microfabriqué avec la technologie de moulage plastique (Ignite® de Precision NanoSystems Inc. Ltd., Vancouver, BC, Canada). La figure 2 montre la coupe transversale du canal de sortie situé en aval des quatre anneaux, comme indiqué dans l'encart (voir la ligne pointillée blanche).

Profil en coupe du canal de sortie (voir la ligne pointillée dans l'encart), avec y représentant la dimension horizontale (c'est-à-dire dans le plan de l'appareil) et z la hauteur. La fonction z(y) définit ainsi le profil du canal, avec le fond du canal pris comme référence (z = 0). Deux ensembles de données sont présentés : les mesures d'intensité (cercles), en supposant une proportionnalité entre l'intensité de fluorescence et z (y), et les mesures de profilométrie optique Veeco (lignes rouges).

Le profil de la Fig. 2 a été obtenu en remplissant les canaux avec une solution d'alcool et de fluorescéine, en les imageant avec un microscope à fluorescence, en collectant le champ d'intensité avec une caméra et en analysant les images avec un ordinateur. Plus la hauteur du canal est grande, plus l'intensité collectée est forte. En travaillant avec de faibles concentrations de fluorescéine (0/1 % w/w) pour éviter le blanchiment, nous avons supposé une proportionnalité entre l'intensité de fluorescence collectée par la caméra et la hauteur du canal. Nous avons vérifié que les profils ainsi obtenus étaient en parfait accord avec la profilométrie optique (voir la ligne rouge de la Fig. 2, obtenue avec le profilomètre optique Veeco). En raison de la technologie de microfabrication utilisée (moulage par injection), les parois du canal n'étaient pas verticales mais légèrement inclinées. D'après la Fig. 2, des angles d'environ 80° ont été obtenus, formant ce que nous appelons des "coins" par opposition avec la partie centrale du canal pour laquelle la hauteur est constante. Dans ce contexte, nous définissons la largeur du canal w comme la distance entre les deux parois inclinées au niveau du plan médian. Dans notre analyse de mélange, nous négligerons ces cales et nous concentrerons sur les parties centrales, qui transportent l'essentiel de la matière que nous voulons produire (dans la cale, à cause du confinement, le fluide, soumis au même gradient de pression que dans la partie centrale partie, est essentiellement stagnante, et nous pouvons supposer qu'elle ne contribue pas au processus de production). La rugosité de surface estimée à partir de la profilométrie optique était de 3 ± 1 µm. Ceci est typique de la technologie d'injection sans post-traitement de surface. Comme l'écoulement est entraîné bien en dessous du début de la turbulence (voir ci-dessous), cette rugosité ne joue aucun rôle dynamique.

Les canaux ont la même profondeur (155 µm -mesurée par profilométrie optique -) et des largeurs différentes. Sur la Fig. 1, les tores ont une largeur de 150 µm, les canaux de connexion 150 µm et les canaux d'entrée et de sortie 280 µm de large (comme illustré sur la Fig. 2). L'appareil a deux entrées. Les canaux d'entrée forment un Y qui se connecte au premier tore.

Le débit total est défini par Q = Q1 + Q2, où Q1 et Q2 sont les débits des fluides injectés aux deux entrées (voir Fig. 1). Dans notre système, deux types d'expériences ont été menées :

Expériences de fluide modèle : Dans ce cas, Q1 correspond à l'eau DI et Q2 à la solution d'éthanol fluorescéine à une concentration massique de 0,1 %.

Expériences LNP : Dans ce cas, Q1 représente la phase aqueuse contenant l'acide nucléique dans un tampon acide, et Q2 représente la phase éthanol avec les quatre lipides solubilisés.

On définit également le FRR (flow-rate ratio) par la relation \(QR = \frac{{Q_{1} }}{{Q_{2} }}\). La plupart des travaux se sont concentrés sur FRR = 3, soit un débit d'eau de trois fois le débit de la solution d'éthanol. Le débit total Q a varié de 0,2 à 20 ml/min. On définit une vitesse caractéristique U comme le débit total Q divisé par la section du canal d'entrée, c'est-à-dire juste avant l'anneau 1 (voir Fig. 1). Les nombres de Reynolds et Dean sont définis par les expressions suivantes :

où h est la hauteur du canal, ν est la viscosité cinématique de l'eau et R est le rayon de courbure des tores. Dans la gamme de débits que nous avons testée, les nombres de Reynolds varient de 10 à 1100, tandis que les nombres de Dean varient entre 4 et 400. Nous étions donc bien en deçà des régimes de développement de la turbulence, qui auraient pu nécessiter un contrôle fin de la rugosité des parois. D'un point de vue dimensionnel, notre système dépend de ces deux nombres, ainsi que des rapports d'aspect et d'un nombre sans dimension caractérisant le processus de diffusion. L'espace des paramètres est grand, et dans cet article, nous tracerons les observables en fonction des débits (qui, d'un point de vue pratique, sont utiles) sans chercher à généraliser les conclusions en utilisant des nombres sans dimension.

Pour les expériences de modèles fluides, la caractérisation du processus de mélange a été réalisée en utilisant des techniques de visualisation. De la fluorescéine a été injectée à une entrée et le fluide injecté à l'autre entrée ne contenait aucun colorant. Le système a été observé avec un microscope à fluorescence équipé d'une source à 480 nm et d'un filtre caméra à 520 nm, soit autour du pic d'émission.

Comme cela se fait classiquement dans la littérature19, l'étude du champ d'intensité de fluorescence renseigne sur le mélange. De même, on définit un indice de mélange H par la formule :

dans laquelle y est la coordonnée transversale au flux, w est la largeur du canal et \(I_{moyenne}\) est l'intensité moyenne sur toute la largeur du canal. Par définition, lorsque H est proche de l'unité, le mélange est élevé. Dans le cas contraire (petit H), le mélange est faible.

Nous avons d'abord considéré les faibles débits, en gardant le rapport de débit FRR égal à 3. Le choix de cette valeur a été motivé par le fait, comme montré plus loin, qu'elle permettait la formation de LNPs avec les tailles appropriées pour la livraison d'ADN ou d'ARN ( environ 100 nm), une distribution de taille étroite et une excellente efficacité d'encapsulation. Une image typique du champ de fluorescence à faible débit est représentée sur la figure 3A.

(A) Champ de fluorescence du micromélangeur pour un débit total Q égal à 0,2 ml/min. Insérer : Distribution théorique du traceur si le colorant suivait les lignes de courant sans diffusion, pour laquelle nous avons supposé qu'il n'y avait pas de recirculation. (B) Profils d'intensité dans la section de sortie du système pour Q = 0,2 (cercle ouvert) et 0,3 (croix) ml/min. La ligne pointillée montre le centre de la couche diffusive et les zones grises montrent les coins discutés dans la section Matériaux. Les mesures ont été effectuées dans le canal de sortie, c'est-à-dire en aval du quatrième anneau (voir la ligne pointillée). Les zones grises sont les biseaux des canaux.

Sur la figure 3, le débit Q2 de la solution d'éthanol est de 0,05 ml/min, tandis que l'eau est injectée à un débit Q1 égal à 0,15 ml/min, de sorte que le débit total Q = Q1 + Q2 est de 0,2 ml/ min. Comme indiqué ci-dessus, le rapport de débit FRR est égal à 3. La figure 3 indique que dans le canal d'entrée collecteur, les deux fluides circulent côte à côte. Le profil d'intensité de la figure 3B montre l'existence d'une couche diffuse. L'épaisseur mesurée de la couche diffuse était de l'ordre de 60 µm, ce qui était plus grand mais du même ordre de grandeur que l'estimation \(l \sim 6\sqrt {DT }\) des couches diffuses basée sur la fonction d'erreur ( où D est la constante de diffusion de la fluorescéine dans l'éthanol (2 10–10 m2/s) et T est le temps de parcours (30 ms pour 0,2 ml/min)). La formule conduit à une épaisseur l de l'ordre de 30 µm. Nous suggérons que le facteur 2 est dû à l'action de faibles recirculations, présentes dans le système même aux faibles débits, localisées à l'entrée ou se développant le long des couronnes. Aussi petites que soient ces recirculations, elles peuvent améliorer considérablement le transport diffusif.

La figure 3A montre ainsi que l'éthanol et l'eau s'écoulent côte à côte. Dans un tel régime, les expressions suivantes tiennent19,20.

où µe et µw sont respectivement les viscosités de l'éthanol et de l'eau. La formule indique que le mélange éthanol fluorescéine occupe 30% de la largeur du canal. Cela se compare bien à la figure 2, dans laquelle la ligne pointillée marquant le centre de la couche diffuse est située à 35 % de la largeur du canal. L'encart de la figure 3A montre le modèle d'écoulement auquel nous nous attendrions s'il n'y avait pas de mouvement tourbillonnant et si la diffusion était négligée.

Comme le débit total Q a été augmenté dans la plage de 0,7 à 4 ml/min, toujours avec FRR = 3, les profils de concentration moyennés dans le temps ont adopté des formes compliquées qui variaient sensiblement d'un débit à l'autre, même si les différences entre les deux les valeurs successives étaient aussi petites que 10 %. Il existe donc une grande variabilité dans cette région. Nous appelons ce domaine le « domaine de transition » et les régimes correspondants « régimes de transition ». La figure 4A montre un champ de concentration typique et la figure 4B un profil de concentration typique obtenu dans ce régime, mesuré à nouveau, dans le microcanal de sortie (voir la flèche).

Champ de fluorescence de la fluorescéine transportée dans l'appareil par l'éthanol pour Q1 = 1,5 ml/min (eau) et Q2 = 0,5 ml/min (éthanol) : (A) Image instantanée du champ de fluorescence. (B) Profil d'intensité moyenné dans le temps (sur une minute) mesuré après le quatrième anneau (voir la flèche), c'est-à-dire dans le canal de sortie. Les zones grises sont les biseaux des canaux.

Dans ce cas, le traceur a envahi le canal mais pas complètement : le profil de concentration, moyenné dans le temps sur une minute, montre un creux prononcé autour de la ligne médiane. Le brassage n'était donc pas complet car certaines régions étaient bien brassées et d'autres le sont moins. Une observation importante est qu'en régime de transition, la fluorescéine a envahi le canal avant d'entrer dans le premier tore. Cela suggère qu'un mécanisme de transport s'est développé à la jonction où les deux fluides se sont rencontrés. Comme indiqué sur la figure 3A, la concentration de colorant avait tendance à s'homogénéiser au fur et à mesure que nous nous déplacions vers l'aval, mais des hétérogénéités subsistaient toujours dans le canal de sortie, comme le montre la figure 3B.

Une caractéristique intéressante que nous avons observée dans la plage de 1 à 4 ml/min était la présence de phénomènes dépendant du temps, comme le montre la figure 5.

(A) Image de fluorescence instantanée prise juste avant le Ring 2 pour Q = 1,5 ml/min, en gardant toujours le FRR égal à 3. (B) Intensité instantanée mesurée au point indiqué par la flèche sur la figure de gauche. Les positions des interfaces pointues variaient dans le temps, donnant lieu à des oscillations de l'intensité de fluorescence locale apparaissant sur le tracé intensité-temps. Les nombres de Reynolds correspondant aux débits indiqués sur le tracé sont, du débit le plus faible au débit le plus élevé, 11, 80 et 330.

Pour obtenir la Fig. 5, nous avons mesuré l'intensité instantanée de la fluorescence en un point fixe pour différents débits. La position du point de mesure est indiquée par un point blanc sur la figure 5A. La figure 5B montre qu'à 0,2 ml/min, il n'y avait pas d'oscillation significative de l'intensité locale. A 1,5 ml/min, des oscillations locales induites par les déplacements de l'interface fluorescéine/eau étaient visibles. Leur amplitude disparaissait à des débits plus élevés (voir la courbe à 6 ml/min). Ces mesures fournissent la preuve de la présence de phénomènes dépendant du temps dans le système. Ils se sont développés dans une gamme étroite de débits, située approximativement entre 1 et 4 ml/min. Nous émettons l'hypothèse qu'à des débits plus importants, le flux était toujours instable, mais le couplage entre les oscillations hydrodynamiques, qui ont tendance à strier le champ de fluorescence, comme on l'observe actuellement dans le mélange chaotique19, et la diffusion moléculaire, qui le lisse efficacement, a finalement produit un champ de concentration homogène. Le cas limite du mélange complet est bien illustré sur la figure 6A.

(A) Champ de fluorescence développé par le micromélangeur pour Q = 20 ml/min ; (B) Trois profils de concentration moyennés dans le temps obtenus pour Q égal à 6 (cercles), 14 (croix) et 20 (plus) ml/min. Les zones grises sont les biseaux des canaux.

La figure montre que le traceur, à l'exception d'une petite région autour du premier anneau, est réparti de manière homogène dans tout le dispositif. Les profils de concentration correspondants sont représentés sur la Fig. 6B pour trois débits, 6, 14 et 20 ml/min, en gardant toujours FRR = 3. Ces profils, à nouveau mesurés au niveau du canal collecteur, à proximité de la sortie (voir le ligne pointillée sur la Fig. 6A), s'effondrer les uns sur les autres.

La figure 7 représente l'évolution du facteur d'homogénéité H, défini précédemment, mesuré dans le canal de sortie pour une gamme de débits embrassant les trois régimes sélectionnés, en gardant à nouveau le rapport de débit FRR = Q1/Q2 égal à 3.

Evolution de l'indice de mélange H en fonction du débit total Q pour un FRR égal à 3, avec des images instantanées typiques de la fluorescéine. Chaque point résulte d'une moyenne d'une minute. La ligne complète a été tracée pour guider les yeux.

Les données sont tracées sur une échelle semi-logarithmique, et le facteur d'homogénéité H a été obtenu en excluant les coins, considérant, comme dit ci-dessus, qu'ils ne contribuent pas de manière significative au processus de production. Les trois régimes que nous avons identifiés à partir de ces mesures sont les suivants :

Q < 0,4 ml/min : Mauvais mélange, associé à des flux côte à côte. Le facteur d'homogénéité H est faible, de l'ordre de quelques pour cent. Le nombre de Reynolds supérieur correspondant de ce régime est 22.

0,4 < Q < 4 ml/min : Régime de transition, associé à un brassage modéré, accompagné de profils de concentration complexes et de phénomènes dépendant du temps. Le facteur d'homogénéité H est compris entre 20 et 80 %. En termes de nombres de Reynolds, le domaine est compris entre 22 et 220. La variation de H d'une mesure à l'autre, même si elles sont moyennées sur des temps longs par rapport au temps caractéristique de l'oscillation, est typique des systèmes dans lesquels les instabilités d'écoulement développer. Cette dispersion est cohérente avec les remarques faites plus haut concernant la variabilité des profils de concentration avec les conditions d'écoulement.

Q > 4 ml/min : Régime fortement mélangé avec des facteurs d'homogénéité supérieurs à 80 % et des profils de concentration plats et reproductibles. La gamme de nombres de Reynolds se situe entre 220 et la valeur maximale atteinte dans l'expérience, c'est-à-dire 1100.

Pour discuter de la Fig. 7, il est intéressant de diviser le système en deux parties, comme illustré à la Fig. 1B :

Section 1 : La région d'entrée, y compris la jonction en V et le canal de connexion au premier anneau.

Section 2 : Le reste du système, y compris les anneaux, les jonctions entre deux anneaux successifs et le microcanal de sortie.

Nos observations peuvent être comparées à celles de Minakov18, dans laquelle deux fluides miscibles ont été injectés à une jonction en T dans un canal rectiligne. La géométrie était donc similaire à la nôtre, sauf que nous avons utilisé une jonction en Y plutôt qu'une jonction en T. Les résultats de ce travail ont été qualitativement confirmés expérimentalement21. Selon ces références, au-delà d'un certain seuil estimé à Re ≈ 20, des tourbillons symétriques de type Dean en forme de S se développent dans la jonction. Ce seuil est proche du nôtre (estimé à 22). Au-dessus de ce régime, un régime stationnaire asymétrique se développe, jusqu'à Re ≈ 150. Le développement d'instabilités oscillatoires apparaît à 240, induisant un déplacement périodique d'un point selle, ce qui, selon le scénario Poincaré-Melnikov, donne lieu à un mélange chaotique. En effet, les travaux de Minakov montrent un mélange efficace juste après le début des écoulements dépendant du temps18. Cette gamme de nombres de Reynolds est cohérente avec le régime que nous avons appelé le « régime de transition », dans lequel le régime d'écoulement latéral ne tient pas, le mélange est modéré, les hétérogénéités sont présentes et les oscillations se développent. Dans notre cas, le régime de transition s'étend à partir d'un nombre de Reynolds égal à 22–220, ce qui n'est pas aussi large que les résultats de Minakov mais cohérent avec lui. Nous pouvons donc suggérer que notre "régime de transition" englobe les tourbillons façonnés, les tourbillons asymétriques et les tourbillons oscillants. Les tourbillons oscillants sont connus pour être extrêmement efficaces du point de vue du mélange19. Cela peut expliquer pourquoi, juste au-dessus du début des oscillations, on atteint ce que l'on appelle des « régimes fortement mixtes ». Ainsi, la comparaison avec les travaux de Minakov fournit des indices pour comprendre, sur une base semi-quantitative, le comportement de notre micromélangeur.

Il est prouvé que les quatre anneaux améliorent l'homogénéisation du colorant. Ceci est illustré sur la figure 5, qui montre que les inhomogénéités à l'entrée du dispositif ont tendance à être lissées au fur et à mesure que nous nous déplaçons vers l'aval. Dans les anneaux, deux parties peuvent être distinguées : l'une est l'anneau lui-même (Partie 1), et l'autre (Partie 2) est le canal collecteur, c'est-à-dire la région où les deux fluides se rejoignent. La partie 1 joue vraisemblablement un rôle mineur dans le mélange parce que, par rapport aux jonctions (c'est-à-dire la partie 2 ou l'entrée V), la courbure est plus petite, et donc les tourbillons de Dean qui peuvent se développer sont plus faibles. D'autre part, la partie 2 peut être considérée comme une jonction en Y, jouant un rôle similaire à l'entrée, améliorant ainsi le mélange. En fait, les observations expérimentales que nous avons faites suggèrent que les événements de mélange commencent d'abord à l'entrée, c'est-à-dire dans la Sect. 1, et répétez dans la partie 2 des anneaux. On peut donc suggérer que la partie 2 complète le travail effectué par la partie 1 concernant le mixage mais ne l'initie pas.

La question que nous abordons maintenant est la relation entre les caractéristiques de mélange telles qu'analysées précédemment et les propriétés LNP obtenues avec le même micromélangeur. Pour effectuer ces investigations, un modèle LNP-pDNA a été utilisé. Les LNP ont été fabriqués à l'aide du plasmide gWiz-GFP prêt à l'emploi et disponible dans le commerce22,23 et de quatre lipides différents avec des rapports molaires optimaux de lipide ionisable/DSPC/cholestérol/PEG-lipide de 50/10/38,5/1,5 et un N /P rapport de 6 pour le groupe amine du lipide ionisable aux groupes phosphate de l'ADNp comme décrit dans la littérature24,25. Le lipide ionisable MC3 (DLin-MC3-DMA) a été choisi parce qu'il s'agit du système de délivrance d'oligonucléotides le plus avancé cliniquement26,27 et qu'il est également disponible dans le commerce. Le rapport molaire entre tous les composants a été maintenu constant et choisi selon la littérature.

Nous avons donc étudié l'effet du débit total Q sur la taille du PNL, la variabilité de taille (PDI - indice de polydispersité), le potentiel ζ et l'efficacité d'encapsulation (EE). Ce travail représente les 'expériences LNP' précédemment définies. Ces caractéristiques clés sont généralement mesurées dès les premières étapes de développement pour contrôler le processus et garantir l'efficacité et la sécurité du produit final. Selon la littérature, idéalement, les tailles des LNP devraient être d'environ 100 nm ou moins pour assurer une biodistribution optimale et une administration efficace des médicaments28 ; Le PDI doit être inférieur à 0,2 pour certifier l'homogénéité du produit ; et les potentiels zêta doivent être légèrement négatifs et l'efficacité d'encapsulation aussi élevée que possible pour assurer un rendement élevé du processus et une protection des acides nucléiques.

Pour analyser la corrélation de ces paramètres avec les conditions d'écoulement, cinq débits Q allant de 0,4 ml/min à 20 ml/min ont été étudiés. Dans ces expériences, de la même manière décrite ci-dessus, le rapport entre les courants aqueux et de solvant a été maintenu égal à 3, et la concentration totale en lipides (1,44 mg/1) et la composition chimique ont été maintenues constantes. Les données sont présentées à la Fig. 8.

Evolution des différentes grandeurs avec le débit, entre 0,4 et 20 mL/min (A) Tailles LNP ; (B) PDI (indice de polydispersité des LNP) ; (C) Efficacité d'encapsulation.

La figure 8A montre que des particules plus grosses ont été obtenues à faible Q (< 1 ml/min). Après une zone de transition dans laquelle les tailles semblaient diminuer, les tailles de particules ont atteint un plateau à environ 100 nm à des débits plus élevés, c'est-à-dire entre 4 et 20 ml/min. Dans l'intervalle, la dispersité des nanoparticules (PDI) a diminué avec l'augmentation du débit, se stabilisant pour Q > 4 ml/min à 7 % (voir Fig. 8B). En parallèle, l'EE était d'environ 60 % inférieure à 2 ml/mn, tandis que les particules formées à un Q supérieur, supérieur à 4 ml/min, avaient une EE d'environ 80 % (voir Fig. 8C). Ces résultats étaient cohérents avec les résultats de l'étude de mélange que nous avons réalisée. Nous avons tracé, sur le même graphique, les limites des trois zones que nous avons distinguées sur la figure 7, c'est-à-dire les régions faiblement mélangées, de transition et fortement mélangées. Notamment, les caractéristiques de la structure LNP sont bien corrélées avec les caractéristiques de mélange du dispositif. De plus, le potentiel ζ, indiquant la charge de surface effective29, a également été mesuré. Quel que soit le débit utilisé, tous les LNP présentaient un potentiel zêta de ζ = − 13 mV + /− 4 mV à pH 7,4 et étaient donc légèrement négatifs. La mesure était cohérente avec Ref25 et suggérait une perte de la charge positive du lipide ionisable.

On peut conclure, d'un point de vue pratique, que lorsque le mélange n'est pas satisfaisant (c'est-à-dire avec un indice d'homogénéité H inférieur à 80 %), les propriétés des structures créées ne sont pas optimales, alors qu'elles atteignent un optimum lorsque le mélange est élevé (H supérieur à 80 %) et les profils d'intensité sont homogènes sur l'ensemble du canal. Nous suggérons que travailler au-dessus de la zone de transition, plus précisément, sensiblement au-dessus des conditions pour lesquelles les écoulements oscillatoires se développent, conduit à des PNL optimales.

Il est important, comme décrit dans Roces et al.5, d'aborder le rôle du rapport de débit FRR. La figure 9 montre les résultats obtenus pour le diamètre LNP D, le PDI et l'efficacité d'encapsulation EE pour un débit total de 4 ml/min et différentes valeurs de FRR variant de 1 à 10.

Courbes obtenues pour un débit total de Q = 4 ml/min. (A) diamètre LNP D en fonction de FRR (c'est-à-dire, l'eau sur le rapport de débit de la solution d'éthanol). Encart : PDI en fonction du FRR. (B) efficacité d'encapsulation EE en fonction de FRR. Encart : Facteur d'homogénéité H en fonction du FRR. (C) : Quantités normalisées tracées en fonction de \(\varepsilon_{m} = \frac{{FRR\varepsilon_{w} + \varepsilon_{e} }}{FR + 1}\) ; \(D^{*} = 1 + 4\frac{{D - D_{\infty } }}{{D_{\infty } }}\left( + \right);\) \(PDI^{*} = PDI/PDI_{\infty }\)(o) et \(EE^{*} = E_{\infty } /EE\) (x).

Pour un FRR inférieur à 2, les caractéristiques LNP n'étaient pas « optimales » (au sens défini ci-dessus) : diamètres supérieurs à 100 nm (Fig. 9A), EE faible (encadré de la Fig. 9B) et PDI élevé (Fig. 9C) ont été observés. A un FRR plus grand, nous avons récupéré les caractéristiques optimales, c'est-à-dire des diamètres proches de 100 nm, un grand EE et un petit PDI (de l'ordre de 6%). Il est important de noter, comme le montre l'encart de la figure 9B, que dans tous les cas, c'est-à-dire à tous les FRR, le mélange était élevé : le facteur d'homogénéité H était en moyenne d'environ 80 %. On peut en déduire que l'origine des pathologies structurales du PNL, pour FRR < 2, n'était pas due à un mélange insuffisant.

La figure 9C permet de proposer une explication. Lorsque l'éthanol (constante diélectrique relative εe = 25) et l'eau (constante diélectrique relative εw = 78) sont mélangés, la constante diélectrique effective (relative) du mélange est égale à \(\varepsilon_{m} = \frac{{FRR\ varepsilon_{w} + \varepsilon_{e} }}{FR + 1}\). La figure 10C montre l'évolution du diamètre D, du PDI et de l'efficacité d'encapsulation EE sous des formes normalisées en fonction de \(\varepsilon_{m}\). Plus précisément, nous avons représenté les quantités suivantes : \(D^{*} = 1 + 4\frac{{D - D_{\infty } }}{{D_{\infty } }},\) \(PDI^{* } = PDI/PDI_{\infty }\), et \(EE^{*} = E_{\infty } /EE\), où '\(\infty^{\prime }\) est la valeur obtenue à FRR > 4mL/min. À haut FRR, \(\varepsilon_{m}\) est proche de celui de l'eau, et les PNL ont des propriétés optimales, tandis qu'à petit FRR, \(\varepsilon_{m}\) est sensiblement plus petit, le paysage énergétique 'vu ' par les constituants du LNP est modifié, et nous pouvons émettre l'hypothèse que cela affecte le processus d'auto-assemblage et donc les morphologies du LNP de manière préjudiciable. Ce type de situation survient lorsque des quantités importantes d'éthanol sont utilisées dans la formulation24,30,31,32. D'après la Fig. 9C, nous estimons que le croisement entre les cas non optimal et optimal se situe autour d'une constante diélectrique relative effective \(\varepsilon_{m}\) proche de 60, toujours pour Q = 4 ml/min, ce qui correspond à une rapport de débit (FRR) de l'ordre de 2.

Images cryo-TEM de LNP composées de MC3, DOPC, PEG-lipide et cholestérol avec une composition molaire de 50/10/1,5/38,5, respectivement, obtenues à différents débits et avec un FRR de 3. (A) LNP préparés en l'absence d'acide nucléique à 4 mL/min. (B) systèmes pDNA-LNP préparés avec p-DNA à 4 ml/min, montrant des surfaces plus texturées. (C) systèmes pDNA-LNP préparés à 0,4 mL/min. Les tailles sont plus grandes et les distributions plus larges (voir la présence de petits et grands PNL).

De cette remarque, on peut suggérer que, de manière optimale, le FRR doit être à la fois suffisamment grand pour maintenir la polarité de la solution proche de celle de l'eau et suffisamment petit pour éviter d'atteindre des dilutions élevées, ce qui diminuerait le rendement du procédé.

Ici, nous analysons la morphologie des nanoparticules produites dans les régimes fortement mélangés à 4 mL/mn et FRR = 3. Nous avons utilisé le cryo-TEM en considérant, à titre de comparaison, des LNP sans ADNp (LNP "vides") et avec acides nucléiques (pDNA LNP). Nous avons également comparé les résultats avec ceux de régimes mal mélangés, comme le montre la figure 10.

Dans les régimes bien mélangés, la taille (près de 100 nm) observée par cryo-TEM était cohérente avec les mesures DLS. Nous avons constaté que les LNP vides avaient des formes sphériques lisses, tandis que les LNP d'ADNp présentaient une interface ondulée (Fig. 10B). Il est probable que l'action des brins d'ADN encapsulés sur la couche lipidique provoque ce phénomène. Dans tous les cas, nous avons constaté que la structure de noyau dense aux électrons de la figure 10 était cohérente avec les LNP fonctionnels à base d'acide rapportés dans la littérature5,8,24,33. Nous pouvons donc conclure que dans des conditions très mixtes et avec FRR = 3, les structures que nous avons trouvées sont « optimales » dans le sens où elles sont cohérentes avec les TNL fonctionnels imagés dans la littérature. Lorsque les TNL sont préparés dans des conditions de mélange faibles (0,4 mL/min, « régime côte à côte »), les mêmes types de structures sont observés, mais les populations semblent adopter des tailles plus grandes, avec des distributions plus larges, conformément à la figure 8A.

Les résultats présentés ci-dessus indiquent qu'une qualité de PNL acceptable (taille faible, PDI faible, potentiels ζ faiblement négatifs et EE élevée) est obtenue lorsque deux conditions sont réunies : un mélange homogène des deux phases utilisées pour la formulation du PNL, avec un facteur d'homogénéité supérieur supérieure à 80 %, et une distribution de phase telle que la constante diélectrique relative moyenne du mélange soit supérieure à 60. C'est la plage de conditions que nous pouvons recommander pour préparer des LNP fonctionnels. Nos résultats suggèrent que, indépendamment de la géométrie du mélangeur, si l'une des deux conditions n'est pas satisfaite, les tailles de LNP, l'homogénéité de taille et l'efficacité d'encapsulation différeront considérablement des valeurs optimales.

Il est intéressant de se demander pourquoi, à faible débit, des PNL anormales. Possédant des tailles significativement plus grandes et des efficacités d'encapsulation plus faibles que les structures optimales sont obtenues. Le profil de fluorescence de la Fig. 3 montre la présence d'une couche diffuse de 60 µm d'épaisseur qui sépare les deux fluides. Au centre de cette couche, le rapport eau/éthanol est d'environ 1:1. Nous pouvons en déduire que dans cette région, les conditions optimales d'auto-assemblage ne sont pas remplies. En revanche, les lipides et l'ADNp sont plus massifs que l'eau et l'éthanol et donc diffusent plus lentement. Au fur et à mesure que les réactifs voyagent en aval, il y aura des périodes de temps pendant lesquelles les lipides subiront cet environnement sous-optimal et précipiteront ainsi. Ce raisonnement peut expliquer les tailles anormales et les faibles performances observées dans les mauvais régimes de mélange.

Notamment, aux débits les plus élevés que nous avons imposés, les LNP ont conservé leur intégrité, indiquant qu'ils ne se sont pas rompus. Ceci peut se comprendre en notant que malgré la vitesse élevée (c'est-à-dire cm/s), à l'échelle du LNP, c'est-à-dire 100 nm, les contraintes de cisaillement sont faibles. Si nous augmentions la taille du système, il n'y aurait aucune difficulté à augmenter le débit et donc le débit, à condition que la contrainte de cisaillement "vue" par le LNP reste au même niveau que dans nos expériences, et que les conditions d'écoulement restent inférieures à la turbulence. début.

Enfin, en utilisant la compréhension que nous avons acquise dans ce travail, nous pouvons tenter de définir les conditions optimales de production de TNL pour le type de mélangeur que nous avons utilisé. Tout d'abord, le débit doit être suffisamment important pour obtenir un mélange élevé. Dans notre cas, un débit minimum de 4 ml/min peut être proposé. Deuxièmement, l'appareil doit être suffisamment long pour que le processus de mélange se développe pleinement. Notre travail suggère que trente fois la dimension transversale est acceptable. Enfin, le FRR doit être suffisamment grand pour maintenir la polarité du milieu proche de l'eau, sans fonctionner avec des facteurs de dilution élevés, ce qui générerait des déchets. Dans notre système, nous pouvons proposer un FRR de l'ordre de 3.

L'article analyse, en profondeur, le processus de mélange se développant le long d'un dispositif incorporant une jonction en Y et quatre anneaux. Dans le contexte TNL, c'est une première. Le dispositif que nous analysons appartient à la catégorie des micromélangeurs inertiels, c'est-à-dire des micromélangeurs tirant parti de l'action des tourbillons inertiels (Dean) et, en attendant, fonctionnant en dessous du début de la turbulence. Ces mélangeurs sont bien adaptés aux hauts débits, condition clé pour envisager une production de masse. De tels débits ne peuvent pas être atteints, par exemple, avec le micromélangeur à chevrons. Dans cet article, nous avons montré que les phénomènes dépendant du temps se développent au-delà d'un certain seuil, proche des travaux numériques de Minakov et al.18. Notre analyse du processus de mélange, ainsi que les mesures LNP, indiquent que les conditions optimales pour produire des structures fonctionnelles nécessitent des débits sensiblement supérieurs au début des phénomènes dépendant du temps. Le raisonnement est que, comme établi dans la littérature sur le chaos (voir, par exemple, Ref19), les tourbillons oscillatoires donnent lieu à un mélange efficace. Nous suggérons que le critère que nous proposons ici (fonctionnant au-dessus du début des régimes d'écoulement oscillatoires) est général. Il devrait être utile pour concevoir des micromélangeurs à haut débit dédiés à la production de LNP.

Les ensembles de données analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs remercient La Ville de Paris, SANOFI, ESPCI, CNRS, PSL et IPGG pour leur soutien. Ils remercient les membres du groupe MMX pour les discussions et L. Dehove pour les chiffres.

Le mot est soutenu par le CNRS, PSL, la plateforme IPGG, l'ESPCI et une bourse de SANOFI.

BioDPD Department, SANOFI, 13 Quai Jules Guesde, 94400, Vitry-sur-Seine, France

Manon Ripoll, Mathilde Enot, Oscar Robbe, Chiara Rapisarda, Jean-René Authelin, Mostafa Nakach & Pierre Wils

Microfluidics, MEMS, Nanostructures Laboratory, CNRS Chimie Biologie Innovation (CBI), UMR 8231, Institut Pierre Gilles de Gennes (IPGG), ESPCI Paris, PSL Research University, 6 rue Jean Calvin, 75005, Paris, France

Elian Martin et Patrick Tabeling

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Marie-Claire Nicolai & Aurélie Deliot

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MR, EM, ME, OR, CR, MCN, AD effectuaient les expériences ; PT, JRA, MN, PW ont discuté des résultats et géré le projet.

Correspondance à Patrick Tabeling.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Ripoll, M., Martin, E., Enot, M. et al. Auto-assemblage optimal de nanoparticules lipidiques (LNP) dans un micromélangeur annulaire. Sci Rep 12, 9483 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13112-5

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Reçu : 09 février 2022

Accepté : 20 mai 2022

Publié: 08 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-13112-5

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